PCR定義
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達調控，基因多態性研究等許多方面。

PCR技術的基本原理
一.PCR反應成分：
1.模板DNA；2.引物；3.四種脫氧核糖核苷酸；
4.DNA聚合酶；5.反應緩沖液、Mg2 等。
二.PCR反應基本步驟：
1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。
2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補區結合（55℃，30s）。
3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應（70～72℃，30～60s）

1.變性(denaturation)：通過加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過程。
2.退火(annealling)：當溫度降低時，引物與模板DNA中互補區域結合成雜交分子。
3.延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg² 存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈。
以上述三個步驟為一個循環，每一循環的產物均可作為下一個循環的模板，經過n次循環后，目的DNA以2ⁿ的形式增加。

•PCR擴增的基本方法

•PCR反應的成分和作用
總體積：一般為25μl～100 μl
（一）無Mg² buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調節反應體系pH值，使Taq酶在偏堿性環境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過50 mmol/L，否則會抑制DNA聚合酶活性。
（二）Mg² :終濃度為1.5～2.0mmol/L，其對應dNTP為200 μmol/L，注意Mg² 與dNTPs之間的濃度關系，由于dNTP與Taq酶竟爭Mg² ，當dNTP濃度達到1 mmol/L時會抑制Taq酶的活性。 Mg² 能影響反應的特異性和產率。
（三）BSA：一般用乙酰化的BSA，起著減少PCR管對Taq酶的吸附作用，對Taq酶有保護作用。
（四）底物（dNTPs）：dNTPs具有較強酸性，其儲存液用NaOH調pH值至7.0～7.5，一般存儲濃度為 10 mmol/L，各成份以等當量配制，反應終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應，但同時增加錯誤摻入和實驗成本；低濃度可提高精確性，而反應速度會降低。
（五）Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補原則為基礎，按5’→3’方向逐個將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈。無3’→5’的外切酶活性，沒有校正功能。某種dNTP或Mg2 濃度過高,會增加其錯配率。用量一般為0.5～5個單位/100μl。
（六）模板：PCR對模板DNA的純度不要求很高，但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結合的蛋白質。
模板DNA的量不能太高，否則擴增可能不會成功，在此情況下可適當稀釋模板。
（七）引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產物或產量過低。引物長度一般15～30個堿基，引物過長或過短都會降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯配也能引發鏈的延伸）。
引物G C約占45～55%，堿基應盡量隨機分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應有互補鏈存在，不能與非目的擴增區有同源性。

•PCR反應條件的選擇（影響因素）
•溫度參數：
1.變性：模板變性完全與否是PCR成功的關鍵，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60s。
2.退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長度在15～25bp可通過公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃計算退火溫度，一般退火溫度在40～60℃之間，時間為30～45s。如果(G C)低于50%，退火溫度應低于55℃。較高的退火溫度可提高反應的特異性。

3.延伸：延伸溫度應在Taq酶的最適溫度范圍之內，一般在70～75℃。延伸時間要根據DNA聚合酶的延伸速度和目的擴增片段的長度確定，通常對于1kb以內的片段1min是夠用的。
循環數：
PCR的循環數主要由模板DNA的量決定，一般20～30次循環數較合適，過多的循環數會增加非特異擴增產物，具體要多少循環數可通過預試驗確定。
PCR產物積累規律：
反應初期產物以2ⁿ呈指數形式增加，至一定的循環數后，引物、模板、DNA聚合酶形成一種平衡，產物進入一個緩慢增長時期（“停滯效應”），即“平臺期”。到達平臺期所需PCR循環數與模板量、PCR擴增效率、聚合酶種類、非特異產物竟爭有關。 
 

PCR擴增儀